Spencer Smith 在實驗室中使用突破性的 Diesel2p 顯微鏡

推進我們對人類大腦的理解將需要對神經回路如何在哺乳動物（包括實驗室小鼠）中發(fā)揮作用有新的認識。這些研究需要使用顯微鏡監(jiān)測大腦活動，該顯微鏡提供足夠高的分辨率以觀察單個神經元及其鄰居。

雙光子熒光顯微鏡顯著提高了研究人員的能力，加州大學圣巴巴拉分校電氣與計算機工程系副教授 Spencer LaVere Smith 的實驗室是推進這項技術的研究溫床。作為 NSF 資助、為期五年、耗資 900 萬美元的下一代多光子神經成像聯(lián)盟 (Nemonic) 中心的首席研究員，該中心誕生于奧巴馬總統(tǒng)的 BRAIN 計劃，總部位于加州大學舊金山分校，Smith 正在努力“推動多光子的前沿用于神經科學研究的顯微鏡?！?/p>

在 11 月 17 日的 Nature Communications 雜志上，Smith 和他的合著者報告了一種新顯微鏡的開發(fā)，他們將其描述為“用于大視場雙光子成像 (Diesel2p) 的雙獨立增強掃描引擎”。他們的雙光子顯微鏡提供了前所未有的大腦成像能力。該設備具有任何此類儀器的最大視野（高達 25 平方毫米），使其能夠提供大腦多個區(qū)域的亞細胞分辨率。?

“我們正在優(yōu)化三件事：查看單個神經元的分辨率，同時捕獲多個大腦區(qū)域的視野，以及捕獲行為期間神經元活動變化的成像速度，”史密斯解釋說?！拔覀儗?a href="/products/camera/" title="成像" target="_blank" >成像感興趣的事件持續(xù)不到一秒鐘，所以我們沒有時間移動顯微鏡；我們必須一次性完成所有工作，同時還要確保光學器件能夠聚焦超快激光脈沖?！?/p>

驅動雙光子成像系統(tǒng)的強大激光器，每個成本約為 250,000 美元，可提供超快、超強的光脈沖，每個脈沖的亮度都是太陽光的十億倍以上，持續(xù)時間為 0.0001 納秒。每秒 8000 萬個脈沖的單光束被分成兩個完全獨立的掃描引擎臂，使顯微鏡能夠同時掃描兩個區(qū)域，每個區(qū)域配置為不同的成像參數(shù)。

新型顯微技術展望：

• 工程光波有望實現(xiàn)快速采集3D顯微鏡圖像
• 新型三維X射線顯微鏡實現(xiàn)對植物細胞高分辨率成像
• 獨特的電子顯微鏡可拍攝運動中的分子
• 新的顯微鏡方法可能會導致細胞生物學的進步

在儀器的先前迭代中，兩個激光器被軛并配置為相同的參數(shù)，這種布置強烈地限制了采樣。最佳掃描參數(shù)（例如幀速率和掃描區(qū)域大?。┮蚍植际缴窠涬娐泛?a href="/products/microscope/0-0-0-0-2129" title="實驗" target="_blank" >實驗要求而異，新儀器允許對兩個光束使用不同的掃描參數(shù)。這種新設備結合了幾個定制設計和定制制造的元件，包括光學繼電器、掃描透鏡、管透鏡和物鏡，因其能夠提供神經活動的高速成像能力而被廣泛采用在廣泛分散的大腦區(qū)域。

Smith 致力于確保對儀器的開放訪問。早在這篇新論文發(fā)表之前，他和他的合著者就發(fā)布了一份預印本，其中包括復制它所需的工程細節(jié)。他們還與波士頓大學的同事分享了這項技術，Jerry Chen 實驗室的研究人員已經進行了修改以適應他們自己的實驗。

“這令人興奮，”史密斯說?！八麄儾槐叵裎覀円粯訌念^開始。他們可以建立在我們的工作之上。Jerry 的論文與我們的論文背靠背發(fā)表，INSS 和 CoSys 兩家公司已經銷售了基于我們設計的系統(tǒng)。由于沒有專利，也不會，這項技術可供所有人免費使用和修改，但他們認為合適?！?/p>

雙光子顯微鏡是一種特殊類型的熒光顯微鏡。為了在史密斯的實驗室中進行此類工作，研究人員對小鼠進行了基因改造，使它們的神經元含有一種神經元活動的熒光指示劑。該指示劑是通過將來自水母的熒光蛋白和自然界中存在的鈣結合蛋白結合而成的。該方法利用了神經元在放電時經歷的短暫的、數(shù)量級的鈣增加。當激光對準神經元時，神經元開始放電，鈣進入，蛋白質找到鈣，最終發(fā)出熒光。

雙光子成像通過利用光子的量子行為來增強熒光顯微鏡，以防止產生大量的離焦熒光。在普通光學顯微鏡中，來自用于激發(fā)樣品的光源的光以一種產生垂直錐體的方式進入樣品，該光錐體縮小到目標聚焦區(qū)域，然后在該點下方形成一個倒錐體。任何不在最窄點的光都失焦。

VMF32A科研用三目電腦落射熒光顯微鏡

雙光子顯微鏡中的光表現(xiàn)不同，產生一個焦點清晰的單點光（并且沒有光錐），消除了到達成像鏡頭的所有失焦光。史密斯解釋說：“圖像只顯示了我們正在觀察的那架飛機的光，沒有來自飛機上方或下方的太多背景信號?！?“大腦具有光學特性和黃油般的質地；它充滿了脂質和水溶液，很難看穿。使用正常的光學成像，您只能看到大腦的最頂部。雙光子成像使我們能夠更深入地成像，并且仍然達到亞細胞分辨率。”

雙光子激發(fā)光的另一個優(yōu)點是它使用能量較低、波長較長的光（在近紅外范圍內）。這種光在穿過組織時散射較少，因此可以清晰地聚焦到更深的組織中。此外，與較短波長的光（例如紫外線）相比，較低能量的光對樣品的損害較小。

史密斯的實驗室在老鼠實驗中測試了該設備，在老鼠執(zhí)行諸如觀看視頻或導航虛擬現(xiàn)實環(huán)境等任務時觀察它們的大腦。每只老鼠的頭骨都植入了一個玻璃植入物，為顯微鏡進入大腦提供了一個真正的窗口。

“我的動機是試圖理解神經電路中的計算原理，這些原理讓我們能夠做一些我們目前無法在機器中復制的有趣事情，”他說?！拔覀兛梢灾圃煲慌_機器來比我們做得更好。但對于其他事情，我們不能。我們訓練青少年駕駛汽車，但自動駕駛汽車在人類無法做到的各種情況下都失敗了。我們用于深度學習的系統(tǒng)是基于大腦的洞察力，但它們只是其中的一小部分，而不是全部。它們工作得很好，但仍然很脆弱。相比之下，我可以把一只老鼠放在它從來沒有去過的房間里，它會跑到我夠不到的地方。它不會撞到任何墻壁。它非常可靠地做到了這一點，并以大約一瓦的??功率運行。

“有一些有趣的計算原理我們還不能在老鼠大腦中存在的人造機器中復制出來，”史密斯繼續(xù)說，“我想開始發(fā)現(xiàn)它。這就是我想制造這臺顯微鏡的原因。”