顯微鏡的七種觀察方式
一、明視野觀察(Bright field\BF)
明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式,廣泛應用于病理、檢驗,用于觀察被染色的切片,所有顯微鏡均能完成此功能。
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二、暗視野觀察(Dark field\DF)
暗視野實際是暗場照明發(fā)。它的特點和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此,視場成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現(xiàn)明亮的像。
暗視野的原理是根據(jù)光學上的丁道爾現(xiàn)象,微塵在強光直射通過的情況下,人眼不能觀察,這是因為強光繞射造成的。若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見。
暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖像。暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察,最高達0.02—0.004。
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三、相差鏡檢法(Phase contrast\PH)
在光學顯微鏡的發(fā)展過程中,相差鏡檢術的發(fā)明成功,是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道,人眼只能區(qū)分光波的波長(顏色)和振幅(亮度),對于無色通明的生物標本,當光線通過時,波長和振幅變化不大,在明場觀察時很難觀察到標本。
相差顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現(xiàn)象,將人眼不可分辨的相位差變?yōu)榭煞直娴恼穹?,即使是無色透明的物質也可成為清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察,因此相差鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡。
相差顯微鏡的基本原理是,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減下,提高反差。在構造上,相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處:
1.環(huán)形光闌(annular diaphragm):位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標本上。
2.相位板(annular phaseplate):在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種:
a. A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標本結構比周圍介質更加變亮,形成亮反差(或稱負反差)。
b. B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結構比周圍介質更加變暗。
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四、微分干涉鏡檢術(Differential interference contrast\DIC)
微分干涉鏡檢術出現(xiàn)于60年代,它不僅能觀察無色透明的物體,而且圖像呈現(xiàn)出浮雕壯的立體感,并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優(yōu)點,觀察效果更為逼真。
原理:微分干涉鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等,光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體,在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小,而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象,使圖像呈現(xiàn)出立體的三維感覺。
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五、偏光顯微鏡(Polarizing microscope\POL)
偏光顯微鏡是鑒定物質細微結構光學性質的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質,在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚,當然這些物質也可用染色發(fā)來進行觀察,但有些則不可能,而必須利用偏光顯微鏡。
偏光顯微鏡的特點,就是將普通改變?yōu)?a href="/products/microscope/pm/" title="偏光" target="_blank" >偏光進行鏡檢的方法,以鑒別某一物質是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性)。
雙折射性是晶體的基本特性。因此,偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物,化學等領域。在生物學和植物學也有應用。
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六、浮雕相襯顯微鏡(RC HMC)
1975年,由Robert Hoffman博士發(fā)明;2002年,專利到期,各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術產品。
1.原理:斜射光照射到標本產生折射、衍射,光線通過物鏡光密度梯度調節(jié)器產生不同陰影,從而使透明標本表面產生明暗差異,增加觀察對比度。
2.特點:
a.提高未染色標本的可見性和對比度;
b.圖象顯示陰影或近似三維結構而不會產生光暈;
d.可檢測玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細胞,器官和組織;
e.聚光鏡的工作距離可以設計的更長;
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七、熒光顯微鏡(Fluorescence Microscopy\FL)
熒光鏡檢術是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體,使之受激發(fā)后而產生長波長的熒光,然后觀察。
1.優(yōu)點:
a.檢出能力高(放大作用);
c.能進行多重染色。
2.用途:
a.物體構造的觀察——熒光素;
c.發(fā)熒光量的測定對物質定性、定量分析。
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