一、培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基（culture medium）是細菌生長繁殖所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)的人工制品。適宜的培養(yǎng)基能使細菌在體外迅速生長繁殖，便于對細菌進行分離和鑒別?？煞譃榛A(chǔ)培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、厭氧菌用培養(yǎng)基和特殊培養(yǎng)基。

1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基

只含有細菌生長所需的最基本營養(yǎng)成分，應(yīng)用最廣泛，為制備多種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)，常見的有肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基。

2、營養(yǎng)培養(yǎng)基

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入葡萄糖、血液、血清、腹水或酵母浸膏等有機物，可供營養(yǎng)要求較高的細菌生長需要或增菌用。如結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基中添加雞蛋、馬鈴薯、甘油等。

3、選擇培養(yǎng)基

利用不同種類細菌對化學物質(zhì)的敏感性不同而制成，使分離菌大量繁殖而抑制其它細菌生長的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中含有的抑制劑能抑制非目的菌生長或使其生長不佳，有利于目的菌的檢出和識別。選擇培養(yǎng)基多為固體平板，用于從標本中分離某些特定的細菌。

4、鑒別培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中加有某些特定成分，如糖、醇類和指示劑等，用于檢查細菌的各種生化反應(yīng)，以資鑒別和鑒定細菌。

5、厭氧菌用培養(yǎng)基

專性厭氧菌須在無氧條件下才能生長，故需在培養(yǎng)基中加入半胱氨酸、硫乙醇酸鈉等還原劑，降低培養(yǎng)基中氧化還原電勢，并應(yīng)與外界空氣隔絕，使培養(yǎng)基本身為無氧的環(huán)境。

6、特殊培養(yǎng)基

為某些需要在特殊條件下才能生長的細菌培養(yǎng)之用。如高滲鹽增菌培養(yǎng)基、高滲糖增菌培養(yǎng)基、改良 Kagan氏培養(yǎng)基等。

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二、培養(yǎng)基的制備

制備一般培養(yǎng)基的主要過程基本相似，包括調(diào)配、溶化、調(diào)整 pH、過濾、分裝、滅菌及檢定和保存。

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三、細菌檢驗室的注意事項及無菌技術(shù)

細菌培養(yǎng)必須隨時為防止污染和病原菌的擴散而進行操作，即無菌操作。細菌檢驗室的注意事項如下：

1、細菌的培養(yǎng)應(yīng)在接種罩或無菌室內(nèi)進行。有條件的實驗室可在超凈工作臺內(nèi)進行。

2、用接種環(huán)分離和移種細菌時，用前用后均需滅菌處理。一般采用火焰滅菌法。

3、從培養(yǎng)瓶或試管培養(yǎng)物中取標本或移種時，在打開瓶口、管口或關(guān)閉前，均要在火焰上通過2～3次。切不可將含菌材料污染臺面和其他物體。

4、如不慎將試管等打破造成菌液污染時，不要驚慌，應(yīng)立即報告負責人，然后用3％來蘇或5％石炭酸處理污染臺面或地面，至少浸泡30分種。

5、工作完畢后，用紫外光燈照射30分鐘，或用3％來蘇擦拭臺面，并清洗雙手。

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四、接種環(huán)和接種針使用

接種環(huán)和接種針由三部分組成，即環(huán)（針）部分、金屬柄部分和絕熱柄部分。接種環(huán)和接種針通常選用電熱（鎳）絲，環(huán)的直徑隨使用目的而不同，一般多為2～4mm，環(huán)和針的長度為40～50mm。

接種環(huán)（針）使用前后均應(yīng)進行滅菌處理，將接種環(huán)（針）末端直立火焰中，燒紅鎳絲部分，再使接種環(huán)（針）金屬柄旋轉(zhuǎn)通過火焰3次滅菌，冷卻后用以取菌或待試標本。使用接種環(huán)（針）完畢后立即將染菌的鎳絲部分于還原焰（內(nèi)焰）中加熱，烤干環(huán)（針）端附著的細菌或標本，以免環(huán)（針）上殘余的細菌或標本因突受高熱，爆烈四濺，而污染環(huán)境和導(dǎo)致傳染危險。然后再移于氧化焰（外焰）中燒紅滅菌，最后將金屬柄部分往復(fù)在火焰中通過3次。用完后的接種環(huán)（針），應(yīng)立即擱置于架上，切勿隨手棄置，以免灼焦臺面或其他物件。

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五、接種操作區(qū)

為避免在接種過程中污染環(huán)境以及空氣中的細菌污染培養(yǎng)物，接種均應(yīng)在接種罩或無菌室內(nèi)進行，此外細菌學實驗室所必需的設(shè)備還包括無菌工作臺、生物安全柜和生物安全實驗室。

1、接種罩

接種罩的式樣很多，可用木框和玻璃制成，亦有用有機玻璃制成。接種罩在用前先以3％石炭酸或來蘇輕拭，內(nèi)需裝有紫外線殺菌燈，用前可先行照射，以保證罩內(nèi)無塵埃和細菌。操作結(jié)束后，應(yīng)立即清理內(nèi)部，并作罩內(nèi)消毒處理。

2、無菌工作臺

又稱超凈工作臺（super clean bench），目前多采用垂直層流的氣流形式。通過變速離心風機將負壓箱內(nèi)經(jīng)過預(yù)濾器過濾的空氣壓入靜壓箱，再經(jīng)高效過濾器進行二級過濾，從出風面吹出的潔凈氣流，以一定的和均勻的斷面風速通過工作區(qū)時，將塵埃顆粒和微生物顆粒帶走，從而形成無塵無菌的工作環(huán)境。使用時應(yīng)提前50分鐘打開紫外線殺菌燈，30分鐘后關(guān)閉并啟動送風機。凈化區(qū)內(nèi)嚴禁存放不必要的物件，以保持潔凈氣流型不受干擾。

3、無菌室

無菌室又稱潔凈室（clean room），是在實驗室內(nèi)部安裝的用于無菌操作的小室。室內(nèi)應(yīng)有空氣過濾裝置、紫外線殺菌燈等。

4、生物安全柜（biological safety cabinet，BSC）

目前微生物試驗中多采用生物安全柜，是為操作原代培養(yǎng)物、菌（毒）株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計的負壓過濾排風柜。

5、生物安全實驗室（Biosafety Laboratory），簡稱“BSL實驗室”

指通過規(guī)范的實驗設(shè)計、實驗設(shè)備的配置、個人防護裝備的使用等建造的實驗室。在結(jié)構(gòu)上由一級防護屏障（安全設(shè)備）和二級防護屏障（設(shè)施）構(gòu)成，實驗室生物安全防護的安全設(shè)備和設(shè)施的不同組合，構(gòu)成了四級生物安全防護水平，一級為最低。

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六、接種法

根據(jù)待檢標本的性質(zhì)，培養(yǎng)目的及所用培養(yǎng)基的種類，采用不同的接種方法。常用的有平板劃線分離培養(yǎng)法、斜面接種法、液體接種法和穿刺接種法。

1、平板劃線分離培養(yǎng)法

分離培養(yǎng)法就是通過劃線使標本或培養(yǎng)物中混雜的多種細菌在培養(yǎng)基表面逐一分散生長，各自形成菌落，以便根據(jù)菌落形態(tài)及特征，挑選單個菌落，經(jīng)過移種而獲得純種細菌（純培養(yǎng)）。分離細菌最常用的為平板劃線分離法。

（1）將接種環(huán)火焰滅菌，待冷卻后取標本或混合菌液。

（2）用左手持起平板，使平皿蓋向上放于臺面上或打開平皿蓋。

（3）左手斜持（45℃角）平板，右手持已取材的接種環(huán)，在酒精燈上方5～6cm處作連續(xù)劃線法分離細菌。劃線時，接種環(huán)與平板呈30～40°角，輕輕接觸平板，以腕力平行滑動接種環(huán)。應(yīng)避免將瓊脂劃破。先在平板上 l／5處輕輕涂布，然后即可左右來回以作連續(xù)劃線接種，線與線間留有適當距離，做到線密而不重復(fù)，將整個平板表面布滿劃線。

如果菌量較大可采用分區(qū)劃線法?？蓪⑵矫蠓譃槿舾蓚€區(qū)（一般為5個區(qū)）。先在平板上 l區(qū)輕輕涂布，再在2，3……區(qū)劃線。每劃完一個區(qū)域，均將接種環(huán)滅菌一次，冷后再化下一個區(qū)域。每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線 l～2次，使菌量逐漸減少，以獲得單個菌落。

（4）劃線完畢，蓋好皿蓋，做好標記將平皿倒置，置37℃培養(yǎng)18～24小時后觀察結(jié)果。

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2、斜面接種法

主要用于劃線分離培養(yǎng)所獲得的單個菌落的移種，以得到純種細菌和保存菌種，以及觀察細菌的某些培養(yǎng)特性。

（1）取菌種管置左手食指、中指、無名指之間，拇指壓住管底部上側(cè)面。

（2）火焰滅菌接種環(huán)。

（3）以右手小指與手掌拔取棉塞（如同時持有兩管，可用小指與無名指拔取另一棉塞），將管口迅速通過火焰1～2次。

（4）將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取少許菌，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線，直至斜面上方頂端。37℃孵箱中培養(yǎng)18～24小時即可觀察結(jié)果。

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3、液體接種法

肉湯、蛋白胨水、發(fā)酵管等均系液體培養(yǎng)基。用于增菌，觀察細菌生長現(xiàn)象和檢測細菌的生化反應(yīng)等。

（1）持好菌種管及培養(yǎng)基管。

（2）滅菌接種環(huán)，由菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調(diào)和，使接種物充分混合于培養(yǎng)基的液體中。

（3）液體培養(yǎng)一般以18～24小時觀察生長特征為好。

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4、穿刺接種法

試管內(nèi)半固體培養(yǎng)基采用此法接種，多用于保存菌種、觀察動力及做厭氧培養(yǎng)等。亦可用于觀察細菌的某些生化反應(yīng)。

（1）持好菌種管和培養(yǎng)基管。

（2）以滅菌接種針從菌種管取菌。

（3）接種針直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達管底部（深入培養(yǎng)基3/4處）或沿管壁刺入（醋酸鉛高層），接種后接種針應(yīng)沿原路退出。

（4）經(jīng)培養(yǎng)后即可觀察結(jié)果。沿穿刺線生長，線外的培養(yǎng)基清亮者表示細菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴散生長，或整個培養(yǎng)基混濁者表示細菌有動力。

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七、培養(yǎng)法

根據(jù)培養(yǎng)目的和細菌的種類選用最適宜的培養(yǎng)方法。常用的有一般培養(yǎng)法、二氧化碳培養(yǎng)法和厭氧培養(yǎng)法。

1、一般培養(yǎng)法

一般培養(yǎng)法系指需氧菌或兼性厭氧菌等在需氧條件下的培養(yǎng)方法，故又稱需氧培養(yǎng)法。將已接種好的置37℃孵箱中培養(yǎng)18～24小時。但標本中菌量很少或難于生長的細菌（如結(jié)核分技桿菌）需培養(yǎng)3～7天甚至1個月才能生長。

2、二氧化碳培養(yǎng)法

某些細菌的培養(yǎng)，需要5～10%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)才能生長良好。可采用二氧化碳孵箱，它能自動調(diào)節(jié)二氧化碳的濃度和溫度，使用極為方便。傳統(tǒng)的方法則采用燭缸法，將培養(yǎng)基放入缸內(nèi)，點燃蠟燭放在缸中，加蓋（涂以凡士林）密閉。因燃燒而產(chǎn)生CO2大約占5～10%，基本可滿足細菌培養(yǎng)的要求。

3、厭氧培養(yǎng)法

厭氧菌標本的采集及運送有特殊的要求及注意事項，應(yīng)避免正常菌群的污染，盡量少接觸空氣并立刻送檢。厭氧菌的培養(yǎng)法可大致分為：

（1）理學方法：遮斷空氣法（層積法）、 真空法、 空氣置換法、厭氧罐培養(yǎng)、厭氧袋法、厭氧手套箱等。

（2）化學方法：焦性沒食子酸法、硫乙醇酸鈉法、黃磷燃燒法。

（3）生物學方法： 需氧菌共生法、燕麥發(fā)芽法。

（4）混合法：真空或氣體置換與焦性沒食子酸法相結(jié)合，可根據(jù)實際情況選用。