一、原理

采用光學(xué)顯微鏡研究一般生物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在自然狀態(tài)下是無法觀察清楚的，多數(shù)動(dòng)植物材料都必須經(jīng)過某種處理，將組織分離成單個(gè)細(xì)胞或薄片，光線才能通過細(xì)胞。為了適應(yīng)這個(gè)需要，就產(chǎn)生了光學(xué)顯微鏡制片技術(shù)。?

光學(xué)顯微鏡的制片技術(shù)方法可分為兩大類：一類是非切片法，另一類是切片法。?

非切片法，是用物理或化學(xué)的方法，使細(xì)胞彼此分離，如有分離法、涂布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡單，能保持細(xì)胞的完整，但是細(xì)胞之間的正常位置往往會(huì)變動(dòng)，無法反映細(xì)胞之間的正常聯(lián)系。它可以與切片法配合使用，各取其長處。?

切片法，是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層，材料須經(jīng)過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁復(fù)。在制作過程中，還要經(jīng)過一系列的物理和化學(xué)的處理，這些處理方法可根據(jù)各種不同材料的性質(zhì)要求進(jìn)行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術(shù)復(fù)雜，但是，它最能保持細(xì)胞間的正常的相互關(guān)系，能較好和較長時(shí)間地保留細(xì)胞的原貌，所以仍然是光學(xué)顯微鏡的主要制片方法。

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二、儀器、材料和試劑

1、儀器：石蠟切片機(jī)、恒溫蠟箱、載玻片、蓋玻片

2、材料：洋蔥根或小鼠肝?

3、試劑：乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚

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三、方法與步驟

光學(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)最簡單的切片法是徒手切片，但是由于組織塊往往十分柔軟，切削很困難，而且無法得到十分菲薄的切片，因此必須先用某些特殊物質(zhì)滲入組織塊的內(nèi)部起支持作用，并將整個(gè)組織塊包住，然后再用精密的切片機(jī)制作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質(zhì)稱為包埋劑。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等，水和塑料也可作為包埋劑。根據(jù)包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長處，可以根據(jù)需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術(shù)。?

石蠟作為包埋劑，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如：石蠟?zāi)芮谐鰳O薄的蠟片（2～10μm）；切片時(shí)能連成蠟帶，便于制作連續(xù)切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長期保存。然而石蠟切片的制作過程較長，步驟很多，一步不慎往往導(dǎo)致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時(shí)受濕度影響比較大，這些不足之處必須在制片過程中認(rèn)真對待，盡量減小它的不良影響。?

石蠟切片的制作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。

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1、取材?

材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量，無論取哪一種動(dòng)植物材料，以下幾點(diǎn)是必須注意的。?

（1）植物材料選擇時(shí)須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動(dòng)物材料取用時(shí)常對動(dòng)物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或?qū)?dòng)物殺死后迅速取出所需要的組織。?

（2）取材必須新鮮，這一點(diǎn)對于從事細(xì)胞生物學(xué)研究尤為重要，應(yīng)該盡可能割取活著的組織塊，并隨即投入固定液。?

（3）切取材料時(shí)刀要銳利，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷。?

（4）切取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm。

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2、固定?

組織和細(xì)胞離開機(jī)體后，在一定時(shí)間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活動(dòng)，會(huì)引起病理變化直至歸于死亡。為了使標(biāo)本能反映它生前的正常狀態(tài)，必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細(xì)胞，阻抑上述變化，并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì)，防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會(huì)使組織適當(dāng)硬化以便于隨后的處理，還會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色。?

固定劑的作用對象主要是蛋白質(zhì)，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作時(shí)不加考慮，如要觀察這些物質(zhì)，可用特殊的方法將其固定下來。?

固定劑的作用表現(xiàn)在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質(zhì)而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是：穿透組織的速度快，能將細(xì)胞中的內(nèi)含物凝固成不溶解物質(zhì)，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。?固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。?

簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細(xì)胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。?

簡單固定劑的局限性較大，如將其適當(dāng)混合，制成復(fù)合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：Bouin氏液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4％甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g＋重鉻酸鉀2.5g＋硫酸鈉1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸餾水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，我們必須依據(jù)各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。

固定時(shí)，須注意以下幾點(diǎn)：

（1）固定劑應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。?

（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì)，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。?

（3）材料固定后如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。?

（4）固定時(shí)間依材料大小和固定劑種類而異，可從一小時(shí)到幾十小時(shí)，有時(shí)中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強(qiáng)，作用時(shí)間應(yīng)嚴(yán)加控制，不能過長。?

（5）一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，一定要在使用前才混合。?

（6）固定完畢，根據(jù)所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉淀，影響以后組織塊的染色。

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3、脫水?

生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時(shí)石蠟無法滲入組織內(nèi)部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。?

脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。?

常用的脫水劑是乙醇，因?yàn)樗?a href="/blog/2603/" title="價(jià)格" target="_blank" >價(jià)格便宜，易于得到。為了避免劇烈的擴(kuò)散引起的組織的強(qiáng)烈收縮，脫水步驟應(yīng)從低到高以一定的濃度梯度來進(jìn)行，一般組織從30%乙醇開始，經(jīng)過50%、70%、80%、95%、100%至完全脫水；對于一些柔軟的組織應(yīng)從15%開始。脫水時(shí)間依據(jù)組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置45min到1h，如果中間須停頓，應(yīng)使材料停留在70%乙醇中，因?yàn)榈蜐舛纫掖家资菇M織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時(shí)間不能過長，另外，脫水必須在有蓋瓶中進(jìn)行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時(shí)停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。

丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強(qiáng)。?甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。?

二氧六環(huán)為無色的石蠟溶劑，對組織沒有收縮及硬化等不良后果，但其蒸汽有毒，使用時(shí)須小心。?正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優(yōu)點(diǎn)是很少引起組織塊的收縮與變脆。叔丁醇的性質(zhì)、作用和用法同于正丁醇，但因其價(jià)格昂貴而很少使用。

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4、透明?

組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過透明。透明劑能同時(shí)與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織。?

透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。

二甲苯作用較快，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時(shí)若脫水不凈，就會(huì)引起不良后果，在應(yīng)用時(shí)必須特別小心。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進(jìn)入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點(diǎn)。透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，—般各級停留時(shí)間在30min至2h，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時(shí)間則以不超過3h為宜。材料經(jīng)過透明，會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時(shí)，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。

甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同，唯沸點(diǎn)較低，透明較慢，但不會(huì)使組織變脆。?

苯的用法同于二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明。

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5、透蠟和包埋?

包埋用的石蠟，熔點(diǎn)在50～60℃之間，應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、切片的厚薄和當(dāng)時(shí)的氣溫條件來選用。一般動(dòng)物材料最常用的石蠟熔點(diǎn)為52～56℃，植物材料的為54～58℃；切片薄的為58～60℃，切片厚的則為52～54℃；室溫10～19℃時(shí)選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點(diǎn)46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。?

石蠟的優(yōu)劣與切片的成敗密切相關(guān)。鑒別石蠟質(zhì)量的方法是：將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點(diǎn)出現(xiàn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細(xì)粒。這種石蠟即為品質(zhì)優(yōu)良。含有雜質(zhì)的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用，方法是將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30min（注意別超過發(fā)火點(diǎn)），使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。?

透蠟須在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點(diǎn)3度，使經(jīng)過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應(yīng)處理2～3次，透蠟的時(shí)間依材料性質(zhì)而定，一般每次需15～30min。透蠟的關(guān)鍵是控制溫度的恒定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟?zāi)虩o法滲透，溫度過高使組織收縮發(fā)脆。

包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準(zhǔn)備好紙盒，將熔蠟倒入盒內(nèi)，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨校蛊溲杆倮鋮s凝固，30min后取出。?

包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶，以后切片時(shí)引起碎裂。

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6、切片?

（1）石蠟塊的固著與整修?

在包埋以后，就可進(jìn)行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機(jī)進(jìn)行切片前還須進(jìn)行固著和整修。?

固著：一般旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上，并使組織塊朝外，便于以后迅速切出所需的片子。?

整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形，還可削去一角以便于在蠟帶上識別切片。

（2）切片機(jī)和切片刀?

切片機(jī)是用來做各種組織切片的一種專門設(shè)計(jì)的精密機(jī)械，常用的是旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)，它的夾物部分是上下移動(dòng)前后推進(jìn)的，而夾刀部分則固定不動(dòng)。主要部件是安裝切片刀的刀臺，安裝包埋塊的標(biāo)本臺和控制切片厚度的微動(dòng)裝置。切片時(shí)切片刀固定不動(dòng)，轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪，標(biāo)本臺上下運(yùn)動(dòng)并按調(diào)好的切片厚度向前推進(jìn)一定的距離，組織塊上下運(yùn)動(dòng)一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。?

切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢后應(yīng)及時(shí)用二甲苯將石蠟油擦凈。

（3）切片方法?

切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進(jìn)行切削。將所要切的包埋塊固定在標(biāo)本臺上，使包埋塊外切面與標(biāo)本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動(dòng)裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度，調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)注意指針不可在兩個(gè)刻度之間，否則容易損傷切片機(jī)，將刀臺移至近標(biāo)本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時(shí)就可以開始切片了。方法是：右手轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪，左手持毛筆在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度后，右手停止轉(zhuǎn)動(dòng)，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi)，注意切片速度不宜太快，搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻，防止切片機(jī)震動(dòng)厲害引起切片厚薄不均勻，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動(dòng)的方向，以防標(biāo)本臺后移而切不到片子。切片完畢，應(yīng)及時(shí)用氯仿將切片機(jī)的有關(guān)部分擦凈。

（4）切片中存在的問題及補(bǔ)救方法?

石蠟切片是很不容易掌握的，有時(shí)很容易成功，有時(shí)則由于某種因素而造成切片的質(zhì)量低劣，甚至完全失敗?，F(xiàn)將切片時(shí)經(jīng)常遇到的一些缺點(diǎn)，可能的原因以及補(bǔ)救辦法列于下表。

7、貼片?

切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進(jìn)一步處理，但是切片常有細(xì)小的橫紋，必須經(jīng)展平后才能貼附，否則影響染色和觀察。貼片一般有撈片法和燙板法。?

撈片法比較簡單，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時(shí)切片都浮在水面上，由于表面張力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個(gè)打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，用筷子充分調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一體積的麝香草酚（thymol）作防腐用，可保存幾個(gè)月到一年）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。?

燙板法，是將涂有粘片劑的載玻片上涂上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片于35℃恒定的燙板上讓切片攤干，并傾斜或用吸水紙吸去水分，最后將載玻片再度放燙板上晾干。?

要注意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必須潔凈，不能有油污（檢驗(yàn)法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水，若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等物在上面）；切片的光面應(yīng)朝下，否則染色過程中切片容易脫落。

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8、染色?

組織切片是無色透明的，必須進(jìn)行染色后才能觀察到各種微細(xì)結(jié)構(gòu)。染色方法很多，但是染色劑往往是水溶液，因此切片必須經(jīng)過脫蠟而再度復(fù)水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由于切片十分菲薄，處理的時(shí)間大大減少，一般每級停留約2～5min。?

染色是一個(gè)復(fù)雜的過程，兼有物理和化學(xué)作用，對其中的機(jī)制目前了解得不是很清楚。研究細(xì)胞器和細(xì)胞內(nèi)的重要組分都有很多現(xiàn)成的方法，例如顯示DNA的Feulgen反應(yīng)，顯示RNA的Brachet反應(yīng)，顯示多糖的PAS反應(yīng)，顯示蛋白質(zhì)的Millon反應(yīng)和顯示某些酶的鈣—鈷法等，可以根據(jù)不同的要求來選用。

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9、透明?

染色后的切片須再次經(jīng)過脫水、透明。標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。

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10、封藏?

封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存，封藏劑必須能與透明劑互溶，對染色無影響，折射率近似玻璃和具有粘性的物質(zhì)，常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。?

封片的方法是：將載玻片從二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在標(biāo)本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹膠，仔細(xì)覆蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，也不得拖動(dòng)蓋玻片，以免將標(biāo)本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定，勿使過多過少。?

貼上標(biāo)簽，注明材料、染色法，待封藏劑凝固后便成為一張成功的石蠟切片。